世界最高速で試料回転を行う固体NMRプローブを開発 超微量の生体試料を高感度で検出

東京工業大学 生命理工学院 生命理工学系の石井佳誉教授（理化学研究所（理研） 生命機能科学研究センター 先端NMR開発・応用研究チーム チームリーダー）と松永達弥助教（理研 同研究チーム 客員研究員）、日本電子株式会社NM事業ユニットNM開発部 第2グループの遠藤由宇生副主査、根本貴宏グループ長、同第1グループの蜂谷健一グループ長、科学技術振興機構 未来社会創造事業 大規模プロジェクト型の小野通隆プログラムマネージャー（理研 生命機能科学研究センター センター長室 高度研究支援専門職）らの共同研究グループは、固体核磁気共鳴（NMR）法^[用語1a]において、世界最高速となる180 kHzの回転速度による超高速マジック角回転（MAS）^[用語2]が可能な検出器（プローブ^[用語1b]）を開発しました。

本研究成果により、超微量の生体試料やナノ材料の高感度^[用語3a]検出、アルツハイマー病に関わる脳由来の微量なアミロイドβペプチド^[用語4]の解析など、先端研究の進展が期待できます。

超高速MASはNMRプローブ中の固体試料を高速回転させ、その分子構造や物性を高分解能^[用語3b]・高感度で観測する手法です。

今回、共同研究グループは、直径約0.4 mmの微小な試料管を高速の気流で回転させるMAS装置を備えたNMRプローブを開発し、従来の世界記録（160 kHz）を上回る180 kHzの高速回転における固体NMR測定を成功させました。180 kHzは毎秒18万回転に相当し、試料管外周の速度は813 km/hと新幹線の2.5倍以上に達します。この超高速回転により、従来比で2倍程度の感度向上が得られ、微量タンパク質試料の2次元NMR^[用語5]測定にも160 kHz条件下で成功しました。

本研究は、2023年7月9日より英国グラスゴーで開催された国際会議『Euromar 2023』の講演で発表されました。

核磁気共鳴（NMR）法は、強い磁場中に置かれた試料中の原子核の核スピンの電磁場に対する共鳴現象（核磁気共鳴現象）により、物質の分子構造や物性を解析する方法です。固体NMR法は固体状態の材料や難溶性の生体試料などの構造解析のために、生命科学、医薬、有機化学、食品、材料科学といった幅広い分野で利用されています。固体NMR法では、磁場に対し54.73度傾けた軸に沿って試料を回転させるマジック角回転（MAS）と呼ばれる方法で高分解能NMRを達成します。

タンパク質など炭素（C）と水素（H）を含む試料では、天然存在比約99％の¹²Cを観測できないため、安定同位体である¹³Cを試料に取り込ませて観測する方法がこれまで主流でした。しかし、近年の高速MAS技術の発展に伴い、¹Hの計測性能が向上したため、¹³Cの観測よりも¹Hを観測する方がより高感度・高分解能で測定できるようになりました。¹Hの固体NMRの測定性能は、MASで試料を回転させるときの回転速度が速くなるほど向上し、より微量の試料に対する測定が可能になります。このため、より高速で試料回転する固体NMR装置の開発が数十年にわたって進められてきました。

100 kHz（毎秒10万回転に相当）超の高速MASを達成するNMRプローブは、2012年に、株式会社JEOL RESONANCE（現：日本電子株式会社）が初めて開発に成功しました。その後、日米欧を中心に、より速い速度で回転するMAS装置の開発が進められ、現在は欧州に拠点を置く研究グループが150 kHzの高速MAS装置の商用化に成功しています。また2022年には、欧州に拠点を置く企業が160 kHzの高速MAS装置の開発を発表しました。

共同研究グループは超高速MAS技術をさらに高度化し、世界初の180 kHz（毎秒18万回転に相当）の回転速度を実現しました。微細加工により、一般的なシャープペンシルの芯より細い直径約0.4 mmの中空のセラミック製の試料管（ローター）を開発しました（図1）。この試料管に試料を詰め、音速（約340 m/s）に近い速度の圧縮ガスを試料管の両端にあるキャップの一方に取り付けた羽根に吹き付けることで、超高速回転を実現します。試料管全体は圧縮ガスを使ったエアベアリング^[用語6]で浮いた状態になっており、周囲の壁との摩擦なく回転します。

左は、180 kHzの回転速度を実現したプローブ。右の一番上は、微細加工により作製した180 kHz用の直径約0.4 mmのMASローター。上から二番目は2012年に初めて100 kHzを越えて開発に成功した直径0.75 mmのMASローター。上から三番目は直径2.5 mmのMASローター。

このプローブを用いた固体NMR実験を理研の共鳴周波数900 MHz（メガヘルツ）^[用語7a]のNMR装置で行い、回転速度に比例する感度と分解能の大幅な向上が示されました。図2に、MASの回転速度を24 kHzから180 kHzまで上げたときのアミノ酸試料（L-アラニン）の¹H固体NMRスペクトルを示します。L-アラニンに含まれる水素は異なる3種類の分子内環境（NH₃⁺、CH、CH₃）にあり、NMRスペクトルではこの違いは分離した3つのピークとして示されます。

24 kHzのスペクトル（紫）は、¹H-¹H間の強い磁気的相互作用のために信号の線幅が非常に広くなり、CHのピークが確認できません。100 kHzで得たスペクトル（緑）は、この相互作用が超高速回転により取り除かれるため、線幅が狭くなり、信号強度が向上して3種類全ての水素の信号が得られています。180 kHzのスペクトル（赤）では、さらに感度と分解能が大幅に向上し、100 kHzの2倍程度の信号強度が得られています。また、測定の速度は感度の2乗に比例するため、180 kHzでの測定は100 kHzの4分の1の時間で可能になります。

縦軸は信号強度、横軸は線幅を示す。右の数字はMAS回転数（kHz）。スペクトルは、回転数によって色付けされている。ピークは左より、NH₃⁺、CH、CH₃の3種類の水素核からの固体NMRの信号を示している。

また、160 kHzの超高速MAS条件下において、タンパク質試料の2次元NMRの測定にも成功しました。さらに、モデルタンパク質であるGB1試料の固体NMR測定にも初めて成功しました（図3右）。タンパク質試料の場合は変性を防ぐために冷却が必要なことから、冷却ガスの影響で安定して超高速回転させることがより難しいにもかかわらず、このスペクトルも80 kHzのMASを用いたスペクトル（図3左）に比べて分解能の大幅な向上が確認されました。測定時間は18分間であり、微量のタンパク質試料を短時間で測定できることも示されました。

固体状態（微結晶状態）のGB1タンパク質（56アミノ酸）に対して、80 kHz（左）、160 kHz（右）の回転速度のMASで得られた¹H-¹³C 2次元NMRスペクトル。試料は有機溶媒を含んだ微量の水溶液に浸されており、溶液内のタンパク質と同等な構造が固体状態で保持されている。スペクトルは、タンパク質の主鎖を構成する¹³C_αとそれに結合する¹H_αの化学シフトを紐づけており、これによって両者の帰属を明確にできる。一般的に、固体NMRの¹Hスペクトルは線幅が数十ppmを超える非常に幅広なスペクトルとなるが、本実験では、直径0.4 mmの細径試料管に詰めた固体試料を毎秒16万回転させることで線幅を大幅に細くし、溶液NMRスペクトルに近いスペクトルを得ている（右）。右側の矢印の帯状のピークは、溶媒信号の消え残りである。

共同研究グループは、今回開発した超高速MAS技術を用いて、アルツハイマー病に関わるアミロイドβペプチドの超微量試料による構造解析などの先進研究を進めていきます。
また、今回の開発で得られた超高速MASプローブと、最近開発したアジア最高磁場の1.01 GHz（ギガヘルツ）^[用語7b]（23.7テスラ）NMR装置^※や現在世界最高磁場を目指して開発中である1.3 GHz（30.5テスラ）NMR装置を組み合わせて利用する予定です。