細胞の運動を「10秒見るだけ」で細胞質ATP濃度がわかる 繊毛運動を利用した細胞質ATP濃度推定法の開発

要点

• モデル藻類を用いて繊毛運動頻度とATP濃度の関係式を確立
• 呼吸や光合成による細胞質ATP濃度の変化を数値化することに成功
• 細胞内代謝状態の非侵襲的かつ迅速なモニタリングが可能

概要

東京工業大学 生命理工学院 生命理工学系の髙野和歌子大学院生と同科学技術創成研究院 化学生命科学研究所の若林憲一准教授らは、細胞内のATP（アデノシン3リン酸、生体内のさまざまな反応のエネルギー源となる化学物質）の濃度を非侵襲的^[用語1]かつ短時間で簡便に推定する手法を、繊毛運動を利用して開発した。

ATP濃度は細胞の代謝状態を反映するため、細胞内のATP濃度測定は基礎生物学的にも医学的にも重要課題であり、これまでにさまざまな測定手法が確立されてきた。今回、研究グループは非侵襲的な細胞内ATP濃度測定を目指し、ある種の真核生物の細胞から生えた毛のような「動く細胞小器官」である繊毛の運動に着目した。繊毛の内部構造「軸糸」^[用語2]は細胞骨格である微小管^[用語3]から成る。微小管上に並んだモータータンパク質ダイニン^[用語4]が隣接する微小管に対してATPの加水分解エネルギーを使って構造変化することで滑り運動が起こり、繊毛は波打ち運動を行う。繊毛は精子や微生物では細胞の運動装置として、また多細胞生物の表面では細胞外液の起流装置として機能し、重要なはたらきをする。また、繊毛の運動頻度（毎秒）はATP濃度依存的であり、繊毛を界面活性剤で除膜してATPを添加すると、露出した軸糸が運動し、その運動頻度はほぼミカエリス・メンテン式^[用語5]に従ってATPの濃度に依存して上昇する。

本研究は繊毛研究モデル生物の緑藻クラミドモナス^[用語6]を材料に、軸糸を運動させる方法を最適化することで、軸糸の運動頻度とATP濃度の関係式を導出した。次に生きている細胞の繊毛運動頻度を計測し、この式に代入して迅速・簡便・非侵襲的に細胞質内ATP濃度を推定することに成功した。この方法は繊毛を持っているさまざまな生物や器官の細胞内ATP濃度の非侵襲的な推定に貢献するものと期待される。

研究成果は12月3日付け「Journal of Biological Chemistry（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー）」電子版に掲載された。

背景

ATP（アデノシン3リン酸、図1）は生体におけるエネルギー通貨と呼ばれ、生体内のさまざまな反応のエネルギー源となる化合物である。ATPは、真核細胞では主としてミトコンドリアにおける好気呼吸（酸素呼吸）や植物葉緑体における光合成の際にATP合成酵素によって生成され、また解糖系^[用語7]などによっても生成される。そして、細胞内のさまざまな反応を駆動するために消費される。したがって、細胞内のATP量やATP濃度は生体の代謝状態を示す重要な指標である。

アデノシンに3つのリン酸基が結合している。リン酸基はアデノシンに近い位置からα位、β位、γ位と呼ばれ、γ位のリン酸の結合が加水分解によって切られるときに放出されるエネルギーが生体内のさまざまな反応に使われる。生体内では多くの場合β、γ位にMg²⁺が配位しており、このMgATP（アデノシン3リン酸マグネシウム）が加水分解酵素の基質になる。

細胞内ATP量の測定のためにさまざまな手法が確立されている。よく用いられるのは、細胞を破砕し、その破砕液に含まれるATPをルシフェラーゼ^[用語8]が触媒する生物発光を用いて検出するという方法で、キット化されて市販されている。細胞が破砕できる限りどのような生物にも適用できるという汎用性の高い方法であるが、細胞を壊すという手間があるため即時性がなく、かつ生きている状態では測定できないという欠点がある。

この欠点を克服するために、生きている細胞内のATPを可視化するツールも、すでに様々なものが開発されている。中でも、蛍光タンパク質や発光タンパク質とATP結合タンパク質ドメインをつなげて作成したセンサータンパク質^[用語9]の遺伝子を目的の細胞に導入し、発現させるものがよく用いられている。これは顕微鏡で蛍光や発光の様子を観察したり、光を検出するプレートリーダーなどで、その光強度を測定したりすることで生体内の様子をリアルタイムで観察することができる優秀な手法である。

一方で、蛍光タンパク質の場合は励起光を照射しなければ観察できず、強すぎる励起光照射は光毒性と呼ばれるダメージを細胞に与えてしまう。特に光合成生物の場合には励起光によって光合成活性に変化が生じ、生体の状態を変えてしまう。また、発光タンパク質の場合は細胞への発光基質^[用語10]の導入という手間が必要である。どちらのタイプでも、センサータンパク質遺伝子を導入するという手間と、生物へのなんらかの侵襲が必要である。

ATPを利用する細胞小器官のひとつに、繊毛・鞭毛がある（図2）。繊毛・鞭毛は細胞から生えた毛のような器官である。精子や藻類細胞のように一つの細胞から1～2本生えている場合には鞭毛、ゾウリムシなどの微生物や哺乳類の気管上皮細胞のように一つの細胞から多数生えている場合は繊毛と呼び分ける生物学上の習慣があったが、本質的に内部の構造や運動のメカニズムは同じである。近年は「繊毛」で用語を統一されつつあるので、ここでは繊毛と呼ぶことにする。

繊毛膜の内部構造「軸糸」の横断面は9＋2と呼ばれる特徴的な構造になっている（図2）。9組の二連微小管（用語4参照）が2本の中心微小管を囲む構造である。各二連微小管の上にはモータータンパク質「ダイニン」が周期的に配列し、ダイニンがATPの加水分解エネルギーを使って構造変化することで隣接する二連微小管との間に滑りを起こす。これが繊毛運動の原動力となる。

（左）クラミドモナス細胞の明視野顕微鏡像。1つの細胞に2本の繊毛が生えている。これを平泳ぎのように動かして、繊毛側を前にして泳ぐ。（右）繊毛を界面活性剤で除膜し、露出した内部構造「軸糸」の横断面を透過型電子顕微鏡で観察したもの。特徴的な9＋2構造をもつ。9組の二連微小管上に結合したダイニンが、隣接した二連微小管に対してATPの加水分解エネルギーを使って滑ることで二連微小管間にたわみが生じる。

繊毛運動の研究には伝統的に「除膜細胞モデル」が使われる（東工大ニュース「ゾンビ・ボルボックス」参照）。まず、界面活性剤処理によって繊毛をもつ細胞の細胞膜を溶解する（この状態の除膜された細胞を細胞モデルと呼ぶ）。当然、細胞は死んでしまうが、図2（右）のように9＋2構造は維持される。ここにATPを加えると、繊毛は再び運動を開始する。細胞自体は死んでいるのに、繊毛運動の再活性化によって泳ぐので、いわば「ゾンビ・クラミドモナス」である。

このとき、横軸にATP濃度、縦軸に繊毛打頻度（1秒間に繊毛打が生じる回数）をプロットする。細胞集団の平均繊毛打頻度は既報の方法（Kamiya, R. 2000 Methods 22(4) 383-387）によって、10秒程度で計測できる。顕微鏡下でクラミドモナスが遊泳する際、1回繊毛を打つ度に細胞が前後に動く（図3）。このときの光のちらつきを光センサーで検出し、パソコンで高速フーリエ変換をしたピーク値が平均繊毛打頻度を示す。

この方法で、さまざまなATP濃度下における細胞モデルの平均繊毛打頻度を計測してグラフにすると、ほぼミカエリス・メンテン式に従うことが以前から知られていた（図4）。ところが、繊毛研究のモデル生物である単細胞緑藻クラミドモナス（図2左）を用いてこの細胞モデル実験を行うと、高いATP濃度の領域では、繊毛打頻度がミカエリス・メンテン式で予想される値よりも小さくなってしまう（図4）。生きているクラミドモナス細胞はもっと高い頻度（～60 Hz）で繊毛を打つので、この実験系に何らかの問題があることが指摘されていた。

（左上）クラミドモナスは2本の繊毛を平泳ぎのように動かして泳ぐ。このとき、繊毛を前から後ろに動かす「有効打」によって大きく前進し、その繊毛を前に戻す「回復打」によって少しだけ後退する。顕微鏡の視野には微視的に明暗のムラがあるため、ある細胞は明るいほうから暗いほうへ、別の細胞は暗い方から明るいほうへ動くことになる。（左下）その様子を光センサーで検出すると、光強度は繊毛打頻度を周波数として振動しながら変動する。この様子をパソコンで高速フーリエ変換する。（右）細胞モデルをさまざまなATP濃度下で動かし、その様子を光センサーを通して観察し、高速フーリエ変換したもの。スペクトルのピークが、10秒間に光センサーの視野を通り過ぎた数十個の細胞の平均繊毛打頻度を示す。

ATP濃度の上昇につれて、繊毛打頻度はミカエリス・メンテン型に上昇する。従来の実験条件（5 mM Mg²⁺を含んだ溶液）ではATP濃度3 mMで繊毛打頻度が低下してしまう（マゼンタの○印）。溶液中のMg²⁺濃度を15 mMに高め、かつ生体内のATP:ADP（アデノシン3リン酸：アデノシン2リン酸）比を模した量のADPを添加することで、この低下が抑えられ、繊毛打頻度がミカエリス・メンテン式によくフィットした。つまり、繊毛打頻度をATPの関数として表現できた。

研究成果

高いATP濃度において細胞モデルの繊毛打頻度が低下しない実験条件を探し出し、繊毛打頻度−ATP濃度の関係式を作れば、生きている細胞の繊毛打頻度を計測することによって非侵襲的に細胞内ATP濃度が算出できるはずである。そこで研究グループは、まず除膜細胞モデル実験の溶液条件を再検討した。高ATP濃度側での繊毛打頻度の低下はATPに配位するMg²⁺（図1）の枯渇が原因であると考えて、従来よりもMg²⁺を増やしたところ、高ATP濃度での運動の低下は抑えられた（図4）。

さらにダイニンの活性制御にADP（アデノシン2リン酸）が必要であるとの知見を参考に、生体内のATP:ADP比を模してATPの1/20量のADPを添加したところ、さらに運動性の向上がみられた。この2つの改善を施して得られた繊毛打頻度とATP濃度の関係はミカエリス・メンテン式に非常によくフィットしたため、得られた式を生体内ATP濃度の算出に用いることにした。生きた細胞の繊毛打頻度をこの式に代入すると、明所で育てた細胞のATP濃度は約2.0 mM（ミリ・モーラー）、暗所で育てた細胞は約1.5 mMと推定することができた。

このように繊毛打頻度から算出した細胞内ATP濃度を、ルシフェラーゼを用いた従来法で測定した濃度（細胞破砕液中のATP量を測定し、細胞数と細胞の大きさから細胞内濃度に換算した）と比べると、どのような条件でも常にルシフェラーゼ法のほうが高い値になった（図5）。光合成不能株と野生株の比較などから、従来法では葉緑体やミトコンドリアなど、膜で囲まれた細胞小器官の中に含まれるATPも全て検出しているのに対して、繊毛打頻度から算出したATP濃度は、細胞質のみの濃度を反映していることが示唆された。

ルシフェラーゼキットと繊毛打頻度それぞれによって、さまざまな株および条件で細胞内ATP濃度を推定したもの。2つの値の高低の傾向は似ているが、どの条件でもルシフェラーゼキットのほうが高い値を示し、野生株の暗条件および葉緑体ATP合成酵素欠損株という「光合成で作られるATPがほとんどない条件」においてその差は縮まった。これらのことから、ルシフェラーゼキットでは、細胞破砕物中に含まれる、葉緑体由来ATPなどを全て検出しているのに対して、繊毛打頻度法では細胞質に存在するATPのみを検出しているためにこのような差が生まれることがわかった。

この方法の利点の1つはその迅速さである。例えば、ミトコンドリアの呼吸活性が細胞質のATP濃度に与える影響を調べたところ、呼吸阻害剤で細胞を処理すると、1分以内にATP濃度が約20%程度低下した。また、光合成阻害剤で処理すると、同様に1分以内に約50%低下した。興味深いことに、この光合成阻害剤によるATP濃度の低下は5～10分でほぼもとのレベルまで解消された。この解消は呼吸活性阻害剤を加えておくと抑制されることから、細胞内で光合成活性が低下すると呼吸活性を向上させて細胞質ATP濃度を保とうとする調節経路、言い換えれば葉緑体とミトコンドリアの間の情報クロストークが、短時間で活性化すると考えられる。

今後の展開

クラミドモナスは光合成や呼吸などのATP合成経路の研究に使われているため、今回開発した方法は、さまざまな阻害剤の効果や、あるいはこれらの経路に異常をもつ変異株の原因遺伝子の細胞質ATP量への寄与の定量に用いることができる。さらに、繊毛を生（は）やす他の生物でも、クラミドモナスの場合の条件検討方法を参考に事前に除膜細胞モデル実験条件を調べることで、ATP濃度推定が行えるであろう。広い生物学の領域で利用できる汎用性の高い手法として使われることが期待される。

論文情報

掲載誌 :	Journal of Biological Chemistry
論文タイトル :	Rapid estimation of cytosolic ATP concentration from the ciliary beating frequency in the green alga Chlamydomonas reinhardtii
著者 :	Wakako Takano, Toru Hisabori, and Ken-ichi Wakabayashi
DOI :	10.1074/jbc.RA120.015263

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• 久堀・若林研究室
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