異種のドーパミン受容体が結合したD1-D2ヘテロ多量体の活性化によってインスリン分泌が調節される 糖尿病治療に向け、新たな発見

東京工業大学 生命理工学院 生命理工学系の上船史弥大学院生（博士後期課程3年）、坂野大介助教、粂昭苑教授らの研究グループは、同 情報理工学院 情報工学系の青西亨准教授、同 科学技術創成研究院の北口哲也准教授、神戸大学 医学研究科の清野進特命教授、高橋晴美特命准教授との共同研究により、血糖値を下げるインスリン^[用語1]を分泌する膵臓β細胞^[用語2]の働きが、2種の異なるドーパミン受容体^[用語3]であるD1受容体とD2受容体が結合したD1-D2ヘテロ多量体^[用語4]によって抑制、調節されることを明らかにした。

高血糖状態が慢性化し、過剰なインスリンの産生・分泌が続くと、分泌を担うβ細胞は疲弊して分泌障害や細胞死を起こすため、インスリン分泌の適切な調節は必須である。この調節を担う物質の1つがβ細胞にある細胞内小胞内でインスリンとともに貯蔵されているドーパミン^[用語5]で、インスリン分泌時に同時に細胞外へ放出され、β細胞の表面にあるドーパミン受容体を介してβ細胞に作用し、インスリン分泌を抑制する。本研究では全反射照明蛍光顕微鏡（TIRFM）^[用語6]による観察などを行い、複数あるドーパミン受容体のうちD2受容体に結合したドーパミンはインスリン分泌を抑制する一方で、シグナルが過剰に働くとβ細胞の機能不全と細胞死を招くことを明らかにした。また、D1受容体とD2受容体が結合したD1-D2ヘテロ多量体を活性化することでインスリン分泌が一時的に抑制されること、さらにこのD1-D2ヘテロ多量体の形成がD2受容体の過剰な働きによる細胞死からβ細胞を保護することも解明した。

β細胞がインスリン分泌能を維持し続けるための機構の一部を明らかにした本研究は、糖尿病に対する創薬研究や再生医療に役立つことが期待される。研究成果はアメリカ糖尿病学会誌「Diabetes」に6月22日付けでオンライン掲載された。

膵臓β細胞で分泌されるインスリンというホルモン^[用語7]は、血糖値を下げる役割を持ち、これが不足したり作用が不十分であったりすると高血糖状態になり、糖尿病の原因となる。慢性的な高血糖状態ではインスリンの要求性が高まり、β細胞では過剰なインスリンの産生・分泌が引き起こされるが、こうした過剰なインスリンの分泌が続くとβ細胞が疲弊し、正しく分泌が行えなくなったり、細胞死を起こしたりして長期的に正常な血糖値を持続することが難しくなる。そのため、インスリン分泌は適切に調整される必要がある。

β細胞は単糖類の一種であるグルコースの濃度に応じてインスリンを分泌しており、食事直後に第1段階となる大量の分泌を行って急激な血糖値の上昇を防いだ後、穏やかで持続的な第2段階の分泌を行い、血糖値を安定に保つ。

この第2段階のインスリン分泌の調節にはさまざまなホルモンや神経伝達物質が関わっており、神経伝達物質として知られるドーパミンもその一種である。

ドーパミンはβ細胞にも存在しており、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）^[用語8]の1つであるドーパミン受容体を介してインスリン分泌を抑制する。

その具体的な仕組みは次の通りだ。（1）ドーパミンは平時、β細胞内で合成され、インスリンが貯蔵されている細胞内小胞内にインスリンとともに取り込まれている。（2）食後などに、インスリンが分泌されるのと同時に細胞外へ放出される。（3）分泌されたドーパミンは、β細胞表面のドーパミン受容体を介して作用し、インスリン分泌を抑制する。

本研究にも参加している粂教授が率いる粂・白木研究室では、これまでにドーパミンの正常な貯蔵がβ細胞の機能維持に重要であることを明らかにしている（Sakano et al., 2020）。しかしながら、β細胞自身が産出、貯蔵、分泌するドーパミンがどのような形でβ細胞の機能を調節しているかの詳細なメカニズムについては不明な点が多かった。そこで同研究室の上船らは本研究を通じ、β細胞自身が合成・貯蔵し、分泌するドーパミンがどのようにインスリン分泌を制御しているのかの解明に取り組んだ。

上船らはドーパミンによるインスリン分泌制御の解明に向け、マウス膵臓β細胞を用い、まずはドーパミン受容体の阻害剤などを用いずに通常時のインスリン分泌動態の解析を行った。インスリンはβ細胞の細胞内分泌小胞に貯蔵されており、単糖類の一種であるグルコースなどの刺激があるとそれに反応し、開口放出^[用語9]によって細胞外へと放出される。

本研究では、短いスパンにおける状況の変化を素早く観察するため、発光速度が速い蛍光タンパク質である「Venus」を利用した蛍光イメージング^[用語10]法を使いながら、細胞膜近傍の観察を可能とする全反射照明蛍光顕微鏡（TIRFM）を用いることによって、分泌されたインスリン顆粒の開口放出の様子を可視化し、解析を行った。その仕組みと結果を図1に示す。

A. TIRFMによる観察の仕組み。緑色に明るく発光する蛍光タンパク質「Venus」を使い、Venusとインスリンとの融合タンパク質を膵臓β細胞に強制発現させた上で、TIRFMで観察する。これにより細胞膜近傍100 nm以内の範囲での蛍光確認が可能となり、細胞膜近傍でインスリン顆粒の開口放出が起きた際に可視化される。
B. 膵臓β細胞のTIRFM画像。右の小さな画像は、橙色の囲み内の0.5秒ごとの連続画像を拡大したもの。分泌顆粒が開口放出される際のｐＨ変化に応じたVenusが明るい蛍光を発することによって、インスリンが分泌されたことがわかる。開口放出のイベント数については、数値計算ソフトMatlab（Mathworks）上で検出するプログラムを作成して、計測を行った。
C. マウス膵臓β細胞におけるグルコース応答性インスリン分泌を、TIRFMを用いて計測し、解析を行った結果。

図1Cを見ると、高グルコース濃度に対するβ細胞でのインスリン分泌は、素早く大量の分泌が行われる1相目（刺激後0～5分程度）と、その後の持続的で緩やかな2相目（5分以降）に分かれる2相性を呈していることが見て取れる。細胞内のドーパミンの合成や貯蔵を阻害すると2相目の分泌が増加したことから、合成・貯蔵されたドーパミンがインスリン分泌2相目を抑制していることが判明した。

ドーパミンの作用はドーパミン受容体を介してもたらされる。このドーパミン受容体には、興奮性のD1様受容体（D1受容体、D5受容体）と抑制性のD2様受容体（D2受容体、D3受容体、D4受容体）があることが知られている。膵臓β細胞上にはこれらの双方が存在しているため、本研究では続いて双方がインスリン分泌にどのように関与するかを、それぞれの受容体に特異的な阻害剤を用いて調べたところ、D1受容体の阻害剤がインスリン分泌を亢進した。一般的にD1受容体はcAMPの合成を促し、cAMPはインスリン分泌を増加させると考えられているため、予想外の結果であった。これはD1受容体がドーパミンによるインスリン分泌の抑制に関与することを示すものであった。

先の結果を受け、本研究ではD1受容体、D2受容体の双方によるインスリン分泌への影響を調べるため、D1受容体を強制発現させる作用を持つ（D1OE）アデノウイルス^[用語11]と、D2受容体を強制発現させる作用を持つ（D2OE）アデノウイルスを作製し、それぞれβ細胞への強制発現を行った上で、全反射照明蛍光顕微鏡（TIRFM）によって両者のインスリン分泌を観察した。その結果、D1受容体を強制発現させたβ細胞は糖応答性インスリン分泌能（GSIS）を示し、ドーパミンによる分泌の阻害はないことが分かった。一方で、 D2受容体を強制発現させたβ細胞では、糖応答性インスリン分泌能が失われていることが明らかになった（図2）。

D1受容体およびD2受容体を強制発現したβ細胞におけるインスリン分泌を、それぞれTIRFMで観察した結果。強制発現を行わなかったコントロール、およびD1受容体の強制発現を行ったものでは糖応答性インスリン分泌能が観測されるが、D2受容体の強制発現を行ったものではインスリン分泌能が消失した。

粂・白木研究室ではこれまでの研究により、マウスβ細胞においてドーパミンD2受容体がアデノシンA2A受容体と結合してヘテロ多量体を形成し、D2受容体単体とは異なる形で下流過程にあるシグナルを調節することを明らかにしている（Sakano et al., 2016）。一方で、中枢神経ではD1受容体とD2受容体のヘテロ多量体形成が新たな下流シグナルを生むことが知られていた（Lee et al., 2004, So et al., 2005）。このことと、今回、野生型とD1受容体強制発現ではドーパミンを添加した時の結果が異なることから、当研究グループでは、D2受容体はD1受容体と結合することによっても、D2受容体単体とは異なる働きによってインスリン分泌を制御していると予想した。

そこで次にマウスβ細胞において、D1受容体とD2受容体が結合したD1-D2ヘテロ多量体の有無について、2種の異なるタンパク質同士が結合するなど非常に近接して存在するときに免疫組織化学的に可視化されるDuolink近接ライゲーションアッセイ（PLA）^[用語12]を用いて確認した。その結果、PLAシグナルが検出されたことから、D1受容体とD2受容体が近接して存在することが確認され、双方の結合によるヘテロ多量体の形成が強く示唆された。特定のタンパク質とその分子の大きさを検出するウエスタンブロット法からもD1受容体とD2受容体のヘテロ多量体と一致する大きさのバンドが分離されたので、D1-D2ヘテロ多量体の存在が支持された。また、ドーパミンを添加すると、PLAシグナルの蛍光強度が増加したことから、ドーパミンがヘテロ多量体形成を促進することが分かった（図3）。

A. D1抗体とD2抗体を用いたPLAシグナル（赤）が観察されたことから、マウス生体から取り出したインスリン陽性のβ細胞（緑）において、D1受容体とD2受容体がD1-D2ヘテロ多量体を形成していることが分かった。
B. D1受容体、D2受容体は単量体またはホモ多量体からD1-D2ヘテロ多量体を形成する。このヘテロ多量体の形成は、ドーパミン存在下で促進される。

D1-D2ヘテロ多量体の存在が確認できたところで、そのインスリン分泌への影響を調べるため、D1-D2ヘテロ多量体を特異的に活性化する作用を持つSKF83959を加えた上で、全反射照明蛍光顕微鏡（TIRFM）を用いてインスリン分泌を観察した。その結果、高グルコース条件下において、SKF83959の添加から2.5分にわたり、インスリン分泌が減少したことが観察された（図4、赤点線枠内）。これはD1-D2ヘテロ多量体の働きによって、インスリン分泌が短期的に抑制されたことを示す。

D1-D2ヘテロ多様体を活性化するSKF83959を加えた上で、全反射照明蛍光顕微鏡（TIRFM）を用いてインスリンの開口放出の観察を行った。その結果、SKF83959の代わりにその溶媒であるジメチルスルホキシド（DMSO）を加えたコントロール（左）と比較して、SKF83959を加えたD1-D2ヘテロ多様体（下）は添加直後の短時間内の分泌イベント数を減少させた（赤枠内）。

最後にD1受容体とD2受容体およびD1-D2ヘテロ多量体が、β細胞の生存に関与するかについて、酵素を使った蛍光色生成により細胞死した細胞を検出するTUNEL法を用いて確認した。具体的には、マウスβ細胞にD1受容体を強制発現させたもの（D1OE）、D2受容体を強制発現させたもの（D2OE）、さらにD1受容体とD2受容体の双方を同時に強制発現させたもの（D1D2OE）を用意し、TUNEL法で細胞死の有無を確認した。すると、D2受容体を強制発現させたもの（D2OE）ではドーパミン存在下で細胞死が増加する一方で、D1受容体とD2受容体を同時に強制発現させたもの（D1D2OE）については細胞死が阻害されていることが明らかになった（図5）。

D2OEではドーパミン（DA）存在下でのTUNEL陽性率が増加するが、D1D2OEではTUNEL陽性率の増加は見られなかった。D2受容体の強制発現は細胞死を誘導するが、D1受容体を同時に強制発現させることで阻害されることが分かる。

このことから、D2受容体を介したドーパミンの作用によってインスリン分泌阻害システムが過剰に働くと、β細胞の機能不全と細胞死が誘導されることが分かった明らかになった。さらに、形成されたD1-D2ヘテロ多量体によって、インスリン分泌を適切に抑制しながら、β細胞機能不全や細胞死が誘導されないように調節が行われていることが推察された （図6）。

D2受容体はドーパミンによって持続的にインスリン分泌を抑制する一方で、過剰に働きすぎれば機能不全と細胞死を誘導する。しかし、D1受容体が同時に存在することで、D1-D2ヘテロ多量体を形成し、一時的な分泌抑制を示しながら細胞死を誘導することなく、適切なブレーキ機構として働く。

本研究によって、膵臓β細胞の機能がドーパミンのD1受容体とD2受容体という2つのGタンパク質共役型受容体（GPCR）の相互作用によって調節されていることが明らかとなった。D2受容体は、“ハブ受容体”として、多くの異なるGPCRと会合することが知られている。個々のGPCRはβ細胞の機能を調節する機構の一端にすぎず、実際には複数のGPCRが協調して働くことで機能を緻密にコントロールしていると予想している。今後、ドーパミン受容体を含めたGPCR同士の相互作用への理解をさらに深めていくことによって、糖尿病治療の新たな治療標的になると期待している。